6163银河线路检测中心(中国)有限公司

RFLP技术于1980年由人类遗传学家Bostein提出。它是第一代DNA分子标记技术。Donis—Keller利用此技术于1987年构建成第一张人的遗传图谱。DNA分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类的研究。RFLP是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致酶切片段大小发生了变化，通过电泳将其区分。

我们可以利用限制性内切酶的特殊属性来对一些SNP进行分型。有些SNP多态位点正好处于限制性内切酶的识别位点处，其中一种多态对应的PCR扩增片断能够被相应的内切酶切动，而另一种却不能，因此通过对酶切后的PCR产物电泳后的片断长度分析可知检测样本在该位点处的基因型。如果检测SNP位点不存在合适的酶切位点，往往可以通过在PCR引物3’端改变个别碱基引入限制性内切酶酶切位点，通过这种引物修饰法可以实现绝大多数SNP位点的分型都能用RFLP分析来实现。

已知的很多SNP位点正好位于限制性内切酶的识别区域，针对这些SNP位点我们就可以使用此方法进行SNP分型。本方法非常适合单个位点大量样品的已知SNP的基因分型研究。

整个技术的示意图（以KpnI酶切位点SNP为例）如下：

技术路线：

样品需求量：基因组DNA满足10-30 ng/μL，总量≥ 500 ng（10个反应）

样本纯度：无色透明，OD260/280 = 1.8~2.0；OD260/230≥ 2.0

样品完整度：琼脂糖电泳检测要求主条带清晰，无明显弥撒及拖尾，无RNA及蛋白污染

样品保存和运输要求：-20°C保存，冰袋运输

RFLP部分客户文章:

1.RFLP荧光检测如何进行多重样本检测？

答：在设计引物阶段，对荧光引物进行2-3个碱基长度区分合成多条荧光引物。在样本实验时将大批量样本按照荧光引物进行对应分组进行PCR扩增，然后在酶切反应时将不同荧光引物组的PCR产物混合后进行酶切。酶切产物上ABI3730XL进行毛细管电泳分离收集荧光信号后用软件分析结果即可达到多重样本在一个反应产物中分型的目的。

2.RFLP检测出现峰高比异常的原因是什么？

答：峰高比已常可能是由于样本存在外源DNA污染，CNV情况，酶切不完全等因素导致。